Xem mẫu
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT COLLAGEN TỪ DA CÁ BASA
TRƯƠNG THỊ ĐƠN*, NGUYỄN THỊ THU HÀ
HỒ THỊ MỸ DIỆU, BẠCH THỊ THU HIỀN, ĐỖ MAI NGUYỄN
Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Huế
*
Email: hyekyo11@gmail.com
Tóm tắt: Collagen của da cá basa được tách chiết bằng phương pháp hóa học thông
qua các giai đoạn khử protein phi collagen, lipit bằng dung dịch NaOH loãng, khử
khoáng bằng citric acid loãng, khử màu, mùi bằng dung dịch H2O2 loãng. Cuối cùng,
tiến hành chiết collagen bằng acetic acid và làm sạch bằng phương pháp thẩm tích
với dung dịch Na2HPO4. Collagen thu được có độ tinh khiết cao, có khối lượng phân
tử thuộc loại collagen loại I, có cấu trúc xoắn, có các thành phần nhóm chức, liên kết
hóa học đặc trưng được xác định phù hợp tương ứng. Dung dịch collagen có hoạt
tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn E. coli và vi khuẩn Samonella sp.
Từ khóa: Collagen, tách chiết collagen, da cá basa.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ hóa dược, hóa mỹ phẩm ngày càng phát triển, đáp ứng nhu cầu về sức khỏe
và sắc đẹp của con người trong nền công nghiệp hóa, hiện đại hóa nước ta hiện nay. Một trong
những sự ưa chuộng hàng đầu là các sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm có nguồn gốc tự nhiên.
Theo đó, nhiều công thức mỹ phẩm với collagen là một thành phần chính vì lợi ích đáng kể mà
collagen đem lại như khả năng giữ ẩm và làm đẹp da tự nhiên. Ngành công nghiệp này đang
liên tục tìm kiếm các sản phẩm sáng tạo, bền vững và thực sự hiệu quả. Vì vậy những nghiên
cứu về nguồn collagen đang được quan tâm và được xem là các giải pháp thay thế đầy hứa hẹn.
Collagen cá gồm các peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, dễ tiêu hóa, hấp thu và phân tán
bởi cơ thể người. Nghiên cứu được công bố vào năm 2015 trong tạp chí Open Nutraceuticals
Journal cho thấy có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng đã được thực hiện nhằm chứng minh hiệu
quả và lợi ích của collagen trên các đặc tính của da, bao gồm hydrat hóa, tăng độ co dãn và
giảm nếp nhăn. Các nhà nghiên cứu kết luận rằng collagen cá là một vũ khí thông minh trong
cuộc chiến chống lại những dấu hiệu lão hóa không mong muốn. Ở Việt Nam trong những năm
gần đây nghề nuôi trồng, khai thác và chế biến thủy sản phát triển đặc biệt là ở các tỉnh Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Hai đối tượng thủy sản nước ngọt chủ yếu là cá tra và cá basa của Việt
Nam đã mở rộng thị trường xuất khẩu sang 24 quốc gia mới, nâng tổng số các thị trường nhập
khẩu cá tra, cá basa của Việt Nam lên 110 quốc gia và vùng lãnh thổ. Cá tra và basa đa phần
được xuất khẩu dưới hình thức fillet, vì thế mà phế liệu thải trong quá trình chế biến như da cá,
xương,… sẽ rất nhiều (chiếm 50 - 60%). Các phế phẩm công nghiệp này chủ yếu được sử dụng
để làm phân bón hoặc làm thức ăn cho gia súc nên hiệu quả kinh tế còn thấp.
Collagen là một trong những protein thành phần chính của cơ thể, đảm nhận nhiều nhiều
chức năng trong cơ thể con người và được ứng dụng rộng rãi trong ngành y dược, mỹ phẩm,
thực phẩm. Chẳng hạn, việc nghiên cứu ứng dụng collagen vào mỹ phẩm đã được tiến hành ở
Đức, tách chiết collagen từ xương và da của trâu, bò, lợn vào năm 1930. Tuy nhiên đến 1990
các nhà khoa học thuộc Viện Hóa học Gdansk Ba Lan tách chiết collagen từ da cá đã gây tiếng
vang toàn cầu. Từ những thành công này, trong những năm gần đây nhiều quốc gia như Mỹ,
Nhật Bản, Hàn Quốc, Ba Lan đã đầu tư vào việc tách chiết collagen để làm nguyên liệu sản
xuất da [8].
178
- KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019
Hiện nay nước ta đã có một số nghiên cứu để dùng da cá làm nguyên liệu sản xuất collagen
vì da cá tra và cá basa chứa hàm lượng collagen khá cao, chất lượng của nó không thua kém
các loại nguyên liệu khác. Chúng ta có nguồn phế liệu da cá rất phong phú rất giàu collagen.
Do vậy, việc nghiên cứu tách chiết collagen từ da cá basa sau khi đã loại được hoàn toàn phần
protein phi collagen cũng như màu, mùi, chất béo bằng nhiều phương pháp nhằm thu được hàm
lượng collagen cao và có chất lượng tốt là nội dung nghiên cứu cần được quan tâm. Mục đích
của nghiên cứu này là xây dựng quy trình thu nhận collagen hiệu suất cao từ da cá basa bằng
phương pháp hoá học. Nghiên cứu này sẽ đề xuất được quy trình tách chiết collagen và xác
định một số tính chất đặc trưng cơ bản của sản phẩm collagen.
2. THỰC NGHIỆM
2.1. Chuẩn bị nguyên liệu
Da cá được rửa bằng nước sạch để loại bỏ bớt mỡ, thịt vụn còn bám trên da. Sau đó cắt
da cá thành nhiều mảnh nhỏ diện tích khoảng 2x2 cm. Da cá được bảo quản đông lạnh nhiệt độ
khoảng – 20 °C cho đến khi sử dụng làm thí nghiệm. Trước khi đem sử dụng, tiến hành rã đông,
rửa sạch bằng nước. Cân 20 gam da cá cho mỗi mẫu thí nghiệm.
2.2. Tách chiết collagen từ da cá basa
Collagen của da cá basa được tách chiết bằng phương pháp hóa học với dung môi chiết
là acetic acid theo một quy trình tách chiết được xây dựng (Hình 1).
Da cá basa
Khử béo
Khử khoáng
Tẩy màu, tẩy mùi
Chiết collagen
Tinh sạch collagen
Collagen
Hình 1. Quy trình tách chiết collagen từ da cá basa
Trước tiên da cá basa nguyên liệu được xử lý bằng dung dịch kiềm loãng NaOH 0,1 M
để loại bỏ tạp chất phi collagen trong 24 giờ. Các khoáng chất như canxi có trong da được loại
bỏ bằng cách ngâm tiếp mẫu trong dung dịch axit citric 0,05 M ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ.
179
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019
Hai quá trình được lặp lại 3 lần ở nhiệt độ phòng để việc tách tạp chất hiệu quả mà vẫn giữ
được sự toàn vẹn cấu trúc của collagen tự nhiên. Mẫu da thu được sau khi xử lý tuần tự 2 dung
dịch trên được tẩy trắng bằng 200 ml H2O2 10% ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ để loại bỏ các sắc
tố màu trên da. Mẫu thu được sau đó được ngâm trong butanol ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
để hòa tan các chất béo còn lại. Tiếp theo mẫu được rửa bằng etanol và sau đó ngâm trong 500
ml dung dịch citric acid 0,05 M ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ để khử tiếp khoáng trong da, sau
đó được rửa sạch nhiều lần bằng nước cất thu được mẫu da trắng, mềm vẫn còn giữ được hình
dạng ban đầu của mẫu nguyên liệu. Quá trình chiết collagen được thực hiện với acetic acid 0,5
M ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Công đoạn làm sạch được thực hiện bằng phương pháp thẩm
tích với dung môi Na2HPO4 0,02 M.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sản phẩm collagen chiết xuất từ da cá basa
Collagen chiết được từ da cá basa gồm 2 sản phẩm: Collagen (dạng dung dịch): không
màu, trong suốt, dạng gel (Hình 2b). Collagen đông khô (dạng rắn): màu trắng, xốp dạng sợi
như sợi bông tự nhiên (Hình 2c).
(a) (b) (c)
Hình 2. (a) Da cá ban đầu (b) Dung dịch collagen (c) Sản phẩm collagen sau đông khô
3.2. Kết quả phân tích một số tính chất đặc trưng của collagen
3.2.1. Quang phổ phân tử UV-Vis
Độ trong suốt quang học của dung dịch collagen đã được xác định bằng quang phổ UV-
Vis (Hình 3). Kết quả cho thấy dung dịch collagen chiết xuất được có độ tinh khiết cao, phù
hợp với nghiên cứu gần đây về cấu trúc nano collagen [3]. Quang phổ UV-Vis của collagen
chiết từ da cá basa có độ truyền ∼80% ở 800 nm và ∼76% ở 400 nm.
Hình 3. Quang phổ UV-Vis của collagen
180
- KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019
3.2.2. Phổ điện di SDS-PAGE
Kỹ thuật điện di SDS-PAGE phân tách các đại phân tử như nucleic acid và các protein
theo trọng lượng và kích thước phân tử của chúng. Theo kết quả phân tích điện di, người ta xác
định được khối lượng phân tử của collagen loại I vào khoảng 200-300 kDa cao hơn so với
gelatin (dưới 200-300kDa) và cao hơn nhiều so với sản phẩm thủy phân collagen (dưới 50kDa).
Kết quả điện di của mẫu collagen chiết xuất từ da cá basa được thể hiện ở hình 4 bên dưới
với thang chuẩn từ 10kDa đến 130kDa từ Bioline. Kết quả cho thấy: Tất cả các mẫu đều cho
kết quả có 3 băng protein xuất hiện với mức độ đậm nhạt khác nhau. Trong đó mẫu sau thẩm
tích 48 giờ thể hiện rõ nhất. Điều này được giải thích do SDS là một tác nhân làm biến tính
protein và tích điện âm cho các phân tử protein. Anion của SDS kết hợp với phân tử protein
bằng dây hữu cơ kỵ nước phá vỡ cấu trúc ba chiều của protein làm chúng duỗi ra, đồng thời
làm cho phần tử protein tích điện âm bằng vô số điện tích âm của SDS. Khi nồng độ acetic acid
giảm xuống theo thời gian thẩm tích thì SDS sẽ chiết tách protein sẽ càng dễ, hàm lượng protein
tăng lên, thể hiện các băng protein rõ nét dần. Từ 3 băng protein thể hiện rõ nét sau thời gian
48 giờ cho thấy trọng lượng phân tử collagen nghiên cứu thể hiện ở các chuỗi polipeptid α chủ
yếu có trọng lượng ở mức trên 100kDa, trên 70kDa, và sự hiện diện của một số chuỗi polipeptid
nhỏ hơn trên 55kDa. Với sự kết hợp của các chuỗi polipeptid α này tạo thành collagen có trọng
lượng phân tử phù hợp kiểu collagen loại I trong da cá [3].
kDa
100
70
55
5
40
5
35
25
15
10
Hình 4. Ảnh điện di đồ SDS. M: khối lượng thang chuẩn protein (10-130kDa, Bioline); KTT: mẫu
không thẩm tích; 12, 24, 36 và 48 là mẫu qua các thời gian thẩm tích khác nhau
Kết quả điện di thu được tương đồng với nghiên cứu của Ogawa M. và cộng sự (2004)
[5] về collagen từ vây và xương của cá gõ biển và cá đầu cừu với trọng lượng phân tử của chuỗi
α1 và α2 lần lượt là 130 kDa và 110 kDa. Trong nghiên cứu của Muyonga J.H và cộng sự (2004)
[4] về collagen type I được chiết xuất từ da cá rô sông Nile cũng cho trọng lượng phân tử của
các chuỗi α khá tương đồng là 120 kDa cho α1 và 115 kDa cho α2. Trong nghiên cứu gần đây
của Ana L. Alves và cộng sự (2017) về thành phần collagen trong da cá biển, các mẫu SDS-
PAGE cho cả collagen chiết xuất từ cá hồi và cá tuyết cho thấy các dải đặc trưng của collagen,
cụ thể là chuỗi α và β. Đối với cả hai loài, phân tích điện di cá hồi (a) và cá tuyết (b) đã chứng
minh sự có mặt của chuỗi α1 và α2, tương ứng với collagen loại I [7].
3.2.3. Ảnh SEM
Cấu trúc của collagen được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở các độ phóng
đại khác nhau. Ảnh SEM của collagen rắn được trình bày trong hình 5. Ảnh SEM cho thấy cấu
trúc của collagen gồm nhiều sợi nano collagen (nanofibril) liên kết với nhau tạo nên mạng lưới
cấu trúc bền vững. Hình 5a cho thấy các sợi collagen xoắn liên kết thành cấu trúc lớn. Hình 5b
181
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019
cho thấy các sợi collagen sắp xếp theo chiều dọc tạo thành các bó sợi lớn. Hình 5c cho thấy rõ
sự sắp xếp có trật tự của các sợi collagen. Ở độ phóng đại thấp, chúng ta có thể quan sát sự liên
kết của các sợi collagen được cuộn tròn thành các mạng với các macropores có các khoảng cách
có kích thước từ 1–10 μm. Các sợi cuộn tròn có phạm vi kích thước rộng từ ∼300 nm đến ∼2
μm đường kính. Phóng to vào các mạng, các sợi cong được quan sát rõ ràng là các bó xoắn ốc
của các cụm nanofibril. Sự sắp xếp xoắn ốc của các sợi nano collagen xảy ra ở các vùng, kích
cỡ và mức độ khác nhau dọc theo các bó. Việc tự tổng hợp các sợi nano collagen bản địa vào
các bó xoắn ốc có thể được quan sát bằng SEM với độ phóng đại cao. Phóng to các bó xoắn ốc,
chúng tôi quan sát các sợi nano riêng biệt như các đơn vị tạo nên sự kết hợp phân cấp các sợi
xoắn ốc lớn hơn (Hình 5c). Các đơn vị sợi nano collagen này có đường kính trung bình ∼50
nm. Chính sự sắp xếp trật tự và liên kết chặt chẽ với nhau mà collagen từ da cá basa rất bền
vững phù hợp với cấu trúc của collagen trong một nghiên cứu cấu trúc collagen gần đây [2].
a b c
Hình 5. Ảnh SEM của collagen thu được từ da cá basa ở các độ phân giải khác nhau.
3.2.4. Phổ hồng ngoại
Phổ FT-IR của collagen chiết xuất từ da cá basa được thể hiện ở hình 6. Các dải hấp thụ
tương ứng với 5 liên kết amide chính: amide A, amide B, amide I, amide II, amide III. Nhóm
amide A của collagen được phát hiện ở peak có số sóng 3375 cm, phù hợp với dải có peak N–
H, đồng thời cũng cho thấy sự có mặt của liên kết hydro (Barth, 2007) [6]. Nhóm amide B được
tìm thấy ở peak có cường độ 2958 cm-1 tương ứng với dao động của nhóm –CH2 (asymetrical
–CH2 stretch) [2]. Đỉnh collagen của amide I được đo ở 1655 cm-1, trong khoảng 1600 –1700
cm-1 đối với vị trí dải amide I nói chung. Đỉnh collagen của amide II được đo ở 1545 cm-1, phù
hợp với khoảng 1540–1600 cm-1 của amide II. Dải amide III collagen đã được phát hiện ở 1240
cm-1, qua đó biểu hiện hình dạng sắp xếp kiểu xoắn ốc tồn tại trong collagen từ da cá basa.
Amide B
Amide III
Amide II
Amide A
Amide I
Hình 6. Phổ FT-IR của collagen.
182
- KỶ YẾU HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN | 12/2019
Kết quả đo phổ FT-IR cho thấy sự xuất hiện các peak của các nhóm chức cơ bản trong phân
tử collagen như –N–H, –C=O trong amit…đều được tìm thấy trong phổ IR của collagen. Một số
dao động trên phổ FT-IR của collagen được trình bày ở bảng 1. Các dải IR này là đặc trưng của
collagen tự nhiên, phù hợp với các kết quả của các nghiên cứu đã được báo cáo [2], [3].
3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của collagen
Theo Hudzicki (2009), nếu giấy tẩm chất nghiên cứu có kháng khuẩn sẽ không cho vi
khuẩn mọc thể hiện bởi vòng kháng khuẩn [1]. Ngược lại vi khuẩn mọc xung quanh khoanh
giấy không có tính kháng khuẩn. Đường kính vòng kháng khuẩn càng lớn, tính kháng khuẩn
càng mạnh. Kết quả kiểm chứng hoạt tính kháng khuẩn của collagen ở hai chủng khuẩn: khuẩn
E. coli với vòng kháng khuẩn lớn có đường kính 28 mm; khuẩn Samonella với vòng kháng
khuẩn có đường kính 11 mm. Như vậy collagen được đánh giá là có hoạt tính kháng khuẩn tốt
đối với hai loại hai khuẩn này.
Bảng 2. Hoạt tính kháng khuẩn của collagen thu được
Vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
E. coli 28
Samonella sp. 11
(a) (b)
Hình 7. Vòng tròn kháng khuẩn (a) E. coli và (b) Samonella sp.
4. KẾT LUẬN
Collagen đã được chiết xuất từ da cá basa với hiệu suất cao bằng phương pháp hóa học
như xử lý kiềm để khử protein và xà phòng hóa lipit, xử lý citric acid để khử bớt khoáng cho
nguyên liệu, chiết bằng acetic acid và được làm sạch bằng phương pháp thẩm tích trong
Na2HPO4. Sản phẩm collagen thu được có các thành phần hóa học và một số tính chất đặc trưng
phù hợp với các tính chất đặc trưng của collagen thu nhận từ thủy sản.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Nguyễn Tấn Đạt và Nguyễn Bá Tiếp (2016), Đánh giá hiệu suất chiết và tác dụng của cao chiết
từ gỗ Tô mộc (Caesalpinia sappan L.) trong dung môi Ethanol với vi khuẩn Escherichia coli,
Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 14(9), tr.1368-1376.
[2] Lương Nguyễn Công Hào (2018), “Sử dụng các phương pháp khác nhau xác định khối lượng
phân tử collagen chiết xuất từ da cá basa (Pangasius bocourti)”. Khóa luận tốt nghiệp,
Trường Đại học Nha Trang.
[3] Hau Van Duong, Trang The Lieu Chau, Nhan Thi Thanh Dang, Duc Van Nguyen, Son Lam Le,
Thang Sy Ho, Tuyen Phi Vu, Thi Thi Van Tran and Thanh-Dinh Nguyen (2018), Self-
aggregation of water-dispersible nanocollagen helices, Biomaterial Sciences, 6, 651.
183
- TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM, ĐẠI HỌC HUẾ | HNKH 2019
[4] Muyonga J. H., Cole C.G. B., Duodu K.G. (2004), Characterization of acid soluble collagen
from skins of young and adult Nile perch (Lates niloticus). Food Chem, 85(1):81-89.
[5] Ogawa M., Portier R.J., Moody M.W., Bell J., Schexnayder M. A., Losso J.N. (2005).
Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black
drum (Pogonia cromis) and sheepshead seabream (Archosargus probatocepahlus), Food
Chemistry, 88(4), 495-450.
[6] Barth A. (2007). Infrared spectroscopy of proteins. John Wiley & Sons Ltd, 9, 1073-1101.
[7] Ana L.Alves, An L. P. Marques, Eva Martins, Tiago H. Silva and Rui L. Reis. Cosmetic
Potential of Marine Fish Skin Collagen, Cosmetics, 2017, 4, 39. Doi: 10.3390.
[8] Lịch sử nghiên cứu collagen. Colly collagen Việt Nam. Cập nhật ngày 31/07/2018.
http://collagen6500.com/tin-tuc/lich-su-nghien-cuu-collagen/, truy cập ngày 21/10/2019.
184
nguon tai.lieu . vn
