1. Trang Chủ
  2. Công nghệ - Môi trường
  3. Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu

Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu

Đồ án tốt nghiệp này được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P. lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh); so sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của một số chủng nấm P. liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và khỏe mạnh. Mời các bạn cùng tham khảo. BỘ GIÁO DỤC VÀ

Thể loại Tài liệu miễn phí Công nghệ - Môi trường

Số trang 78

Ngày tạo 10/11/2021 12:06:01 AM +00:00

Loại tệp PDF

Kích thước 1.82 M

Tên tệp

Tải Đồ án tốt nghiệp: Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và ... (.pdf)

Xem mẫu

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HỆ ENZYME NGOẠI BÀO VÀ KHẢ NĂNG KÝ SINH TUYẾN TRÙNG Meloidogyne spp. CỦA CÁC CHỦNG NẤM Purpureocillium lilacinum PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TRỒNG TIÊU Ở VŨNG TÀU Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : Th.S LÊ THỊ MAI CHÂM Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ NGỌC TRINH MSSV: 1151110383 Lớp: 11DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được xuất phát từ yêu cầu trong công việc để hình thành hướng nghiên cứu. Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng, tuân thủ đúng nguyên tắc và kết quả trình bày trong đồ án được thu hoạch trong quá trình nghiên cứu là trung thực chưa được từng được ai công bố trước đây. Tp.HCM, ngày .... tháng ..... năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Trinh ii
  3. LỜI CẢM ƠN Mọi sự nỗ lực đều được đền đáp bằng những thành quả tốt đẹp và mọi trái ngọt đều do bàn tay con người vun xới. Để có thể đạt được những kết quả như ngày hôm nay, em biết ơn vô cùng và xin được tỏ lòng biết ơn bằng những lời cầu chúc tốt đẹp và lời cảm ơn sâu sắc nhất đến: Xin được gửi đến BGH Trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh cùng toàn thể quý thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường đã truyền dạy cho em những kiến thức cùng những bài học kinh nghiệm vô cùng quý giá. Xin gửi đến Ban Giám Đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh nói chung và các anh chị trong Phòng Công nghệ vi sinh nói riêng. Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về trang thiết bị vật chất cũng như những sự quan tâm giúp đỡ, giúp em hoàn thành tốt bài luận này. Không thể không nhớ bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc đến Th.s Lê Thị Mai Châm và kỹ sư Nguyễn Thùy Dương, những người đã tận tình hướng dẫn trong quá trình tiến hành cũng như từng bước giúp em hoàn thiện hơn bản thân và những bài học kinh nghiệm quan trọng trong bước đường tương lai. Nhờ sự động viên dìu dắt của thạc sĩ đã tạo động lực cho em trong suốt quá trình thực hiện. Cuối cùng, xin được cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ và tạo những điều kiện tốt nhất. Chính những kết quả này sẽ luôn là trang bài học quý giá với em trong suốt quãng đường phía trước. Tp.HCM ngày … tháng… năm 2015 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Trinh iii
  4. MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1 2. Mục tiêu đề tài .....................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ................................................................2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3 1.1 Sơ lược về đặc điểm rễ cây hồ tiêu ....................................................................3 1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật ..........................................................4 Phân loại ...............................................................................................................4 Hình thức ký sinh trên thực vật ............................................................................5 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. ....................................................................5 Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. ....................................................5 Vòng đời của tuyến trùng M. incognita ............................................................6 Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. ............................6 Đặc điểm gây hại...............................................................................................8 Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. ..................................9 1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum .................................................9 1.3.1 Hệ thống phân loại ......................................................................................9 1.3.2 Phân bố ......................................................................................................10 1.3.3 Đặc điểm hình thái ....................................................................................11 Hình thái đại thể ..............................................................................................11 Hình thái vi thể ................................................................................................11 1.3.4 Đặc điểm sinh hóa .....................................................................................12 Sơ lược về hệ enzyme ngoại bào ....................................................................12 Enzyme protease ..........................................................................................12 Chitinase ......................................................................................................14 1.3.5 Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của P. liacinum ........15 Nhiệt độ ...........................................................................................................15 pH ....................................................................................................................16 iv
  5. Nguồn dinh dưỡng ..........................................................................................16 1.3.6 Khả năng kiểm soát và sự ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng ............................................................................................................................17 Cơ chế của quá trình xâm nhập và kí sinh tuyến trùng ...................................18 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................19 2.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ......................................................................19 2.2 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................19 2.3 Vật liệu, dụng cụ, hóa chất, thiết bị dùng trong thí nghiệm ............................19 Vật liệu ...............................................................................................................19 Dụng cụ ..............................................................................................................19 Thiết bị ...............................................................................................................19 Các môi trường và thuốc thử sử dụng ................................................................20 2.4 Nội dung nghiên cứu........................................................................................23 2.5 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................23 2.5.1 Phương pháp định tính hệ enzyme ngoại bào của nấm P. lilacinum - Phương pháp đo vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch ........................23 2.5.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của nấm P. lilacinum.................................................................................................24 2.5.3. Bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .............................................................25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................27 3.1 Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào của các chủng nấm P. lilacinum ......27 3.1.1. Kết quả định tính hệ enzyme ngoại bào protease của các chủng nấm P. lilacinum .............................................................................................................27 3.1.2. Kết quả định tính hệ enzym ngoại bào chitinase của các chủng nấm P. lilacinum .............................................................................................................32 3.2 Kết quả khảo sát khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên tuyến trùng Meloidogyne spp. ...................................................................................................38 3.2.1. Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp.................................................................................................38 v
  6. 3.2.2 Khảo sát, so sánh khả năng ký sinh của P. lilacinum trên khối trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. ......................................................................................41 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................45 4.1. Kết luận ...........................................................................................................45 4.2. Kiến nghị.........................................................................................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................46 PHỤ LỤC ...................................................................................................................1 vi
  7. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT BR – VT : Bà Rịa – Vũng Tàu BVTV : Bảo vệ thực vật IJ2 : Infective Juvenile 2 M : Meloidogyne MT : Môi trường NN-PTNT : Nông nghiệp- phát triển nông thôn PDA : Potato Dextrose Agar P : Purpureocillium TCA : Trichloroacetic WA : Water Agar CTV : cộng tác viên vii
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách các chủng nấm P. lilacinum được phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở Vũng Tàu................................................................................................................22 Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .............................................................................27 Bảng 3.2. Đường kính vòng phân giải casein của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh ...................................................................................30 Bảng 3.3. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme protease theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau ................................31 Bảng 3.4. Vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe mạnh .............................................................................................33 Bảng 3.5. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh ...................................................................................35 Bảng 3.6. Tỷ lệ phần trăm về mức độ tiết enzyme chtinase theo thời gian của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau .................................37 Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên con cái Meloidogyne spp. theo thời gian .....................................................................................................................38 Bảng 3.8. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh con cái Meloidogyne spp. của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian ..40 Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của nấm P. lilacinum trên khối trứng Meloidogyne spp. theo thời gian .............................................................................................................41 Bảng 3.10. Tỷ lệ phần trăm về mức độ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. của các chủng P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất khác nhau theo thời gian..........44 viii
  9. DANH MỤC BIỂU ĐỒ, HÌNH ẢNH Biểu đồ 3.1. Đường kính vòng phân giải casein trung bình của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. ....................31 Biểu đồ 3.2. Đường kính vòng phân giải chitin của các chủng nấm P. lilacinum phân lập từ hai hệ sinh thái đất trồng tiêu theo thời gian. .........................................36 Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ ký sinh con cái Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ...................40 Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ ký sinh khối trứng Meloidogyne spp. trung bình của nấm P. lilacinum phân lập từ hai hê sinh thái đất khác nhau theo thời gian. ..................43 Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp.. ...................................8 Hình 1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250C ..11 Hình1.3. Cơ quan mang bào tử và bào tử nấm .........................................................12 Hình 3.1 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ vùng rễ tiêu khỏe. Nhóm 1(A), nhóm 2 (B), nhóm 3 (C), nhóm 4 (D). .....................28 Hình 3.2 Đường kính vòng phân giải casein sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu bệnh. Chủng nấm nhóm 2 (A), nhóm 3 (B) và nhóm 4 (C). ............30 Hình 3.3 Đường kính vòng phân giải chitin sau 72h của các chủng nấm phân lập từ đất vùng rễ tiêu khỏe. Chủng nấm nhóm 1 (A) và nhóm 2 (B). ................................34 Hình 3.4 Đường kính vòng phân giải chitin của chủng nấm HT1.1 sau 48h (A) và 72h (B).......................................................................................................................36 Hình 3.5 Con cái Meloidogyne spp. bị nấm P. lilacinum ký sinh khi chụp dưới kính soi nổi ở độ phóng đại 4X. Con cái chưa bị ký sinh (A), nấm bắt đầu xâm nhập và ký sinh con cái (B) và con cái bị nấm ký sinh hoàn toàn (C). ..................................39 Hình 3.6 Khối trứng Meloidogyne spp. bị nấm ký sinh. Khối trứng bắt đầu bị nấm tiếp xúc (A), sợi nấm bao phủ xung quanh khối trứng sau 9 ngày (B), khối trứng bị nấm ký sinh sau 14 ngày (C). ....................................................................................42 ix
  10. Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Theo báo cáo thống kê 6 tháng đầu năm của Bộ NN- PTNT Việt Nam năm 2014 sản lượng tiêu xuất khẩu đạt 111.000 tấn tăng 36% về lượng và 48% giá trị. Có thể nói, cây hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực đẩy mạnh phát triển kinh tế các địa phương, góp phần ổn định đời sống kinh tế của đất nước. Cây hồ tiêu được phát triển với quy mô và tốc độ khá lớn tại các tỉnh miền Trung và Khu vực Đông Nam Bộ. Đặc biệt là Bà Rịa- Vũng Tàu, theo thống kê của Sở NN- PTNT năm 2013, BR-VT đứng thứ 4 cả nước về diện tích trồng tiêu với tổng diện tích trồng gần 8.000ha đạt sản lượng hơn 12000 tấn, đứng thứ 4 cả nước (Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam). Tuy nhiên, việc sản xuất hồ tiêu trong những năm qua bị tổn thất đáng kể do cây thường bị bệnh với những dấu hiệu như: rễ có nhiều nốt sưng, lá vàng, cây khô chết dần mà một trong những nguyên nhân là do tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp. (Phạm Văn Biên, 1989 và Nguyễn Ngọc Châu, 1990). Đây được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất trong nông nghiệp. Nhóm tuyến trùng này phân bố rộng khắp và ký sinh trên hầu hết các loại cây trồng ở các vùng khí hậu khác nhau. Hiện nay, khoảng hơn 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loài ký sinh gây hại phổ biến là: M. incognita, M. arenaria, M. javanica và M. hapla (Vũ Triệu Mân, 2007). Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu hiện nay là sử dụng thuốc hóa học nhưng vẫn chưa tiêu diệt triệt để. Bên cạnh đó, việc sử dụng thuốc cũng đem lại những lo ngại: tồn dư thuốc trong nông sản, làm mất cân bằng hệ vi sinh vật, ảnh hưởng đến môi trường sinh thái, hiện tượng kháng thuốc gây phát sinh những dịch bệnh khác nghiêm trọng hơn…Còn rất nhiều những mối nguy hại không thể kể hết. Trong khi đó, việc áp dụng các tiến bộ trong công nghệ sinh học cũng như ứng dụng công nghệ vi sinh còn rất hạn chế, những lo ngại cũng như tâm lý khi sử dụng các sản phẩm vi sinh lại hoàn toàn rất lạ và mơ hồ với chính những người nông dân. Trong tình hình đó, việc nghiên cứu và chọn lọc các vi sinh vật bản địa có khả năng ký sinh tuyến trùng gây hại là vấn đề đáng quan tâm và như mở ra cánh cửa 1
  11. Đồ án tốt nghiệp mới trong việc chủ động phòng trừ tác nhân gây bệnh, nhằm giảm thiệt hại và nâng cao chất lượng và sản lượng cây trồng. Một trong những giải pháp hữu hiệu góp phần đảm bảo an toàn cho cây trồng cũng như người sử dụng, đáp ứng yêu cầu giữ cân bằng hệ vi sinh vật và gìn giữ môi trường. Nấm Purpureocillium lilacinum đã được chứng minh có khả năng kí sinh khối trứng và con cái của tuyến trùng (Jatalas và cs, 1979). Ngoài ra, chúng còn có thể sống hoại sinh trong đất xung quanh vùng rễ cây (Tigrano và cs, 1995). Do đó, năm 2014 Trung tâm Công nghệ sinh học đã tiến hành xác định sự phân bố của nấm này ở vùng Đông Nam Bộ, trong đó có Vũng Tàu. Việc phân lập, xác định hoạt tính enzyme ngoại bào hay khả năng kí sinh tuyến trùng của các chủng nấm phân lập từ các hệ sinh thái đất trồng tiêu khác nhau là rất cần thiết. Đó là lý do tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hệ enzyme ngoại bào và khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne spp. của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ đất trồng tiêu ở Vũng Tàu.” 2. Mục tiêu đề tài  Khảo sát, so sánh khả năng tiết enzyme ngoại bào protease, chitinase của các chủng nấm Purpureocillium lilacinum (P. lilacinum) phân lập từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh vàng lá (bị bệnh) và đất vùng rễ tiêu không bị bệnh vàng lá (khỏe mạnh).  So sánh khả năng xâm nhập vào khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne spp. của một số chủng nấm P. liacinum đại diện từ đất vùng rễ tiêu bị bệnh và khỏe mạnh. 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn Ý nghĩa khoa học Là một trong những nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng kí sinh tuyến trùng của nấm P. lilacinum phân lập từ đất vùng rễ tiêu ở vũng Tàu. Ý nghĩa thực tiễn Từ nghiên cứu này có thể xác định được sự tồn tại của các chủng nấm P. lilacinum có hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase cũng như khả năng kí sinh tuyến trùng mạnh trong đất trồng tiêu góp phần vào việc định hướng sử dụng chế phẩm vi sinh phòng trừ tuyến trùng hại tiêu trong tương lai. 2
  12. Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc về đặc điểm rễ cây hồ tiêu Hệ thống rễ hồ tiêu thường gồm 3 -6 rễ cái và một chùm rễ phụ nằm dưới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Chỉ có những cây tiêu trồng bằng hạt mới có rễ cọc. Rễ này đâm sâu xuống đất khoảng 2,5m và giữ nhiệm vụ hút nước. Các rễ cái cũng làm nhiệm vụ chính là hút nước. Đối với những cây trồng bằng giâm cành, sau khi trồng ra ngoài nọc được 1 năm các rễ cái này có thể đâm sâu khoảng 2m. Các rễ phụ mọc thành chùm, phát triển theo chiều ngang, rất dày đặc. Phân bố ở độ sâu 15 – 40cm, làm nhiệm vụ hút nước và chất dinh dưỡng trong đất để nuôi cây. Rễ bám mọc ra từ các đốt phần thân dây tiêu, giúp cho dây bám vào choái, vách tường, …để vươn lên cao. Khả năng hút nước và chất dinh dưỡng của rễ bám là rất hạn chế và hầu như là không đáng kể. Rễ cây tiêu thuộc loại háo khí, không chịu được ngập úng, do đó để tạo cho rễ cái ăn sâu, cây chịu hạn tốt và rễ phụ phát triển tốt hút được nhiều chất dinh dưỡng thì phải thường xuyên có nhiều phương pháp cải tạo làm cho đất được tơi xốp và tăng hàm lượng mùn. Chỉ cần ngập úng trong nước từ 12 – 24 giờ thì bộ rễ tiêu sẽ bị tổn thương đáng kể, có thể dẫn tới thối rễ và dây tiêu sẽ bị chết. Một số sâu bệnh phát triển trên cây tiêu Trên rễ cây hồ tiêu thường xuất hiện một số bệnh: Mối hại tiêu: mối xông đất tạo thành đường di chuyển trên trụ, dây và rễ tiêu. Mối gây hại phần non của rễ, phần vỏ của thân và tạo vết thương trên các bộ phận này tạo điều kiện cho nấm và tuyến trùng có hại xâm nhập và gây bệnh cho tiêu. Rệp sáp giả (Pseudococidae) : gây hại trên đọt non, lá non, chùm quả, dây tiêu trên mặt đất hoặc gốc tiêu, rễ tiêu trong lòng đất. Bệnh chết nhanh: nguyên nhân do nấm Phytophthora, do tác động của tuyến trùng, côn trùng, chăm sóc, xới xáo, ngập úng… làm tổn thương rễ, sau đó nấm xâm nhập và gây hại. Bệnh gây hại trên tất cả bộ phận của cây. Bệnh chết chậm: do nhiều loại nấm gây hại: Fusarium sp., Rhizoctonia sp., Pythium sp., … Các loại nấm này tồn tại trong đất, trên tàn dư của cây trồng trước, 3
  13. Đồ án tốt nghiệp cây giống… Cây bị bệnh sinh trưởng chậm, lá nhạt, màu vàng hoặc biến dạng. Hoa quả rụng dần từ gốc đến ngọn. Các đốt cũng rụng dần, gốc thối, bó mạch thân cây hóa nâu. Bên cạnh đó bệnh tiêu cũng bị nhiều loài tuyến trùng gây hại, trong đó có hai loài gây hại nặng nề nhất là tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne và tuyến trùng đục hang Radopholus (Michel Luc, 2005). Tuyến trùng thực vật là nhóm động vật không xương sống, thích nghi với đời sống ký sinh trên thực vật. Nhóm tuyến trùng này có một số đặc trưng quan trọng phân biệt rõ ràng với nhóm ký sinh trên động vật và các nhóm sinh thái khác: có kích thước hiển vi, phần miệng có cấu tạo kim hút chuyển hóa để châm chích mô thực vật và hút chất dinh dưỡng, kích thước trứng lớn so với kích thước cơ thể, đời sống của chúng có quan hệ bắt buộc và trực tiếp với thực vật đang phát triển. Trong đó, cấu tạo kim hút chuyển hóa là khác biệt quan trọng nhất (Nguyễn Bảo Vệ và ctv 2005). 1.2 Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật Phân loại Dựa vào các đặc điểm về hình thái, tập quán sinh sống, đặc tính sinh vật học, mối quan hệ giữa các nhóm tuyến trùng thực vật đối với cây trồng mà chúng được chia làm 4 bộ : Bộ Tylenchida: gồm hầu hết các loài tuyến trùng là đại diện cho các nhóm ký sinh ở các phần khác nhau của thực vật. Bộ Aphelenchida: gồm các loài tuyến trùng ký sinh ở các phần trên mặt đất của cây như lá, hoa. Bộ Dorylaimida: gồm các loài thuộc họ Longidoridae là nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh thực vật, một số loài có khả năng mang truyền virus. Bộ Triplonchida: gồm các loài của 2 họ Trichodoridae và Diphterophoridae là nhóm ngoại thực vật, nhiều loài có khả năng mang truyền virus. Trong đó bộ Tylenchida là nhóm tuyến trùng đông đảo nhất và có tầm quan trọng nhất trên phạm vi toàn thế giới. 4
  14. Đồ án tốt nghiệp Tuyến trùng thực vật sống và ký sinh trên tất cả các cơ quan của cây đang phát triển hoa, lá, thân, rễ…trong đó rễ là nơi chịu ảnh hưởng nhiều nhất những tác động của tuyến trùng (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000). Hình thức ký sinh trên thực vật Có thể chia thành 3 nhóm: Ngoại ký sinh, bán nội ký sinh và nội ký sinh di chuyển. Ngoại ký sinh là tuyến trùng không xâm nhập vào bên trong cơ thể thực vật mà bám vào bên ngoài bề mặt rễ, chúng dùng kim hút để châm chích và hút dinh dưỡng bên trong cây. Bán nội ký sinh: chỉ phần đầu của tuyến trùng xâm nhập vào trong rễ, còn phần sau tuyến trùng vẫn ở ngoài đất. Nội ký sinh: toàn bộ phần cơ thể tuyến trùng xâm nhập vào rễ. Nội ký sinh di chuyển : tuyến trùng có khả năng di chuyển trong mô thực vật, chúng di chuyển từ mô này đến mô khác để dinh dưỡng. Nội ký sinh cố định: sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng dinh dưỡng tại một nơi cố định (tạo nên các tế bào dinh dưỡng) chúng mất khả năng di chuyển và trở lên phình to (béo phì). Các kiểu ký sinh này không loại trừ lẫn nhau vì một số giống tuyến trùng có thể là nội ký sinh hay ngoại ký sinh di chuyển phụ thuộc vào vật chủ. Ở tuyến trùng sần rễ (Meloidogyne spp.) và tuyến trùng bào nang (Heterodera/ Globora), ấu trùng tuổi 2 là giai đoạn xâm nhập vào rễ. Nhưng ở các tuyến trùng ngoại ký sinh và hầu hết tuyến trùng nội ký sinh di chuyển thì hầu như tất cả các giai đoạn đều có thể dinh dưỡng và xâm nhập vào rễ (Vũ Triệu Mẫn, 2007). 1.2.1 Tuyến trùng Meloidogyne spp. Đặc điểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. Tuyến trùng sần rễ (root knot nematodes) được coi là nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng nhất. Chúng gây hại hơn 3000 loài thực vật trên toàn thế giới, bao gồm hầu hết các cây trồng quan trọng: rau màu, đậu, ngũ cốc, cây ăn quả, thảo mộc và nhiều cây cảnh thân gỗ khác (Malcolm & Charles, 2000). Tuyến trùng làm giảm sản lượng thu hoạch cũng như chất lượng cây trồng. Theo thống kê có khoảng 80 loài ký sinh thuộc giống này, trong đó có 4 loại ký sinh gây nên ảnh hưởng nghiêm trọng: M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. 5
  15. Đồ án tốt nghiệp halpha (Vũ Triệu Mân, 2007). Một số loài Meloidogyne gây hại khá phổ biến và quan trọng đối với thực vật hiện nay:  M. incognita là loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại trên nhiều cây trồng khác nhau và phân bố trên vùng địa lý rộng trên phạm vi toàn thế giới. Đây cũng là loài gây hại phổ biến trên cây trồng Việt Nam, trong đó chúng gây nhiều nhất trên : hồ tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, các cây họ cà, cây họ đậu…  M. javanica là loài phổ biến thứ 2 sau M. incognita và có dải phân bố rộng tương tự. Đây là loài có khả năng chịu đựng qua mùa khô hạn trong thời gian 3 – 6 tháng. Ở Việt Nam, loài này cũng ký sinh khá phổ biến trên các cây họ đậu, chuối…  M. arenaria là loài phổ biến thứ 3 sau 2 loài trên, phân bố khắp thế giới. Đây là loài gây hại phổ biến trên các cây họ đậu ở Việt Nam.  M. graminicola ký sinh gây hại trên cây lúa ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới là chủ yếu (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ…) Ở nước ta, loài này ký sinh trên tương đối nhiều trên cây lúa ( giai đoạn lúa non, khi chưa ngập nước ) ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Tuyến trùng Meloidogyne spp. (Kofoid & White, 1919; Chitwood, 1949) là tuyến trùng nội ký sinh rễ: giống Meloidogyne, Họ Meloidogynedae, Bộ Tylenchida. Vòng đời của tuyến trùng M. incognita Vòng đời tuyến trùng M. incognita phát triển qua 5 giai đoạn chính : trứng (ấu trùng tuổi 1), ấu trùng tuổi 2 (ấu trùng cảm nhiễm), ấu trùng tuổi 3, ấu trùng tuổi 4 và tuyến trùng trưởng thành. Giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm ở trong đất, các giai đoạn khác hình thành và phát triển trong rễ cây. Trong chu kỳ vòng đời này ở tuyến trùng Meloidogyne spp. thì giai đoạn ấu trùng tuổi 2 và tuyến trùng trưởng thành giúp xác định loài (Nguyễn Vũ Thanh, Nguyễn Ngọc Châu, 1993) Cấu tạo thành cơ thể con cái và vỏ trứng Meloidogyne spp. Cơ thể tuyến trùng gồm 3 phần: đầu, giữa và đuôi. Phần đầu còn được gọi là vùng môi. Phần đầu ở chính giữa có miệng chích hút có khi có mấu nhỏ nhô lên, hai đầu hơi nhọn hoặc hình tròn dẹt. Phần thân ở giữa chứa ruột giữa và cơ quan sinh 6
  16. Đồ án tốt nghiệp dục. Phần đuôi có nhiều dạng khác nhau: hình kim nhọn, hình thoi thon dài, có mấu gai hoặc không. Con cái trưởng thành hình cầu, nằm sâu trong mô rễ. Đường kính cơ thể 0,5– 0,7 mm với cổ cân đối. Vỏ cutin màu trắng nhạt, mỏng và phân đốt. Lớp vỏ cutin tương đối bền và có thể co giãn được. Vỏ cutin về cơ bản được chia thành 3 lớp : epidocutin, exocutin và endocutin (Bird, 1984). Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa. Ngoài ra năm 1986, Reddigari cũng đã tách được thành phần protein collagen từ 3 lớp của vỏ cutin của M. incognita với một lượng khác nhau ở mỗi lớp. Trên vỏ cutin có các lỗ của hệ tiêu hóa, hệ sinh dục, hệ bài tiết, và một số các lỗ khác của các cơ quan tiết hoặc thụ cảm khác nhau. Phía trong gắn với vỏ cutin là hạ bì và hệ cơ soma. Bên trong thành cơ thể là xoang cơ thể mà thực chất là giả xoang, không được bao bọc bằng cấu trúc biểu mô. Nó được tạo áp lực thường xuyên làm cho cơ thể tuyến trùng luôn ở trạng thái căng phồng lên. Áp lực này cũng có tác dụng làm giảm tác động lên cơ soma và cho phép tuyến trùng vận động được. Xoang cơ thể chứa các tế bào tuyến khác nhau hệ tiêu hóa và hệ sinh sản. Cơ thể tuyến trùng có thể chứa các cấu trúc xương hóa hoặc kitin hóa, là cấu trúc cutin dày lên hoặc đậm nét khi quan sát dưới kính hiển vi quang học (Nguyễn Ngọc Châu, 2003). Trứng được con cái đẻ ra bên ngoài cơ thể vào khối gelatin nằm trên bề mặt của sần rễ. Đôi khi các bọc trứng này cũng nằm bên trong nốt sần. Có hình bầu dục dài hay hình quả thận, cũng có loại trứng hình tròn và tương đối lớn. Vỏ trứng là phần cứng bên ngoài của trứng tuyến trùng, giúp bảo vệ khỏi các tác nhân hóa học và vi sinh vật tấn công. Lớp vỏ trứng có thể có từ 1 – 5 lớp tùy thuộc vào từng loài tuyến trùng. Các cấu trúc phổ biến nhất có lớp nội lipid, một lớp chitin ở giữa (thành phần chính) và một lớp vitelline ngoài (Bird và McClure, 1976).. Lớp bên ngoài bao gồm các vitellin protein. Lớp rào cản đầu tiên bên ngoài giúp ngăn cản sự xâm nhập của nấm lên trứng. Trong Bộ Tylenchida, tuyến trùng M. javanica, lớp vitelline là rất mỏng (10-40 nm) và chứa lipoprotein. Vỏ trứng của tuyến trùng sần rễ M. hapla có hơn 40% protein (Wharton, 1980). Dày 400 nm là lớp chitin lớn 7
  17. Đồ án tốt nghiệp được kết hợp với protein để tạo thành một phức tạp chitin-protein. Vỏ trứng M. javanica chứa 50% protein và 30% chitin (Bird và Bird, 1991). Vai trò chính của lớp chitin có thể đảm bảo độ bền cấu trúc vỏ trứng và để bảo vệ lớp lipid. Các lớp lipid bao gồm một loạt các màng lipoprotein (Wharton, 1980) và dày nhất ở các đầu (0.02- 0.04 µm). Các lớp lipid chịu trách nhiệm chống thấm của một số vỏ trứng, và nó bảo vệ trứng hạn chế chất độc hại (Wharton, 1980). Nếu các lớp chitin được loại bỏ, lớp lipid là dễ dàng bị hư hỏng …(Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000) Hình1.1 Khối trứng và con cái tuyến trùng Meloidogyne sp.. Đặc điểm gây hại Quan sát mô học chỉ ra rằng sự xâm nhập của ấu trùng tuổi 2 xuất hiện nhiều nhất tại vùng mô phân sinh rễ. Tuyến trùng ở đất xâm nhập vào rễ tiêu ở giai đoạn ấu trùng cảm nhiễm IJ2. Sau khi xâm nhập vào rễ, tuyến trùng khu trú tại một chỗ và dùng kim hút chọc thủng tế bào mô trụ của rễ, tiết men tiêu hóa vào mô để thực hiện dinh dưỡng. Tại đây, tuyến trùng nhanh chóng phát triển qua các giai đoạn để phát triển thành tuyến trùng trưởng thành (tuyến trùng đực dạng chỉ dài, tuyến trùng cái hình quả lê). Dưới tác dụng của men tiêu hóa do tuyến trùng tiết ra, các tế bào xung quanh tuyến trùng phát triển bất thường, tạo thành các tế bào khổng lồ có nhiều nhân. Rễ phình to ra tạo thành u hay nốt sần, hệ rễ bị biến dạng. Những nốt 8
  18. Đồ án tốt nghiệp sần này có thể nhỏ, riêng biệt hay to và xếp thành chuỗi, phụ thuộc vào mức độ nhiễm của cây ký chủ ( Nguyễn Ngọc Châu và ctv.,1990). Các biện pháp phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne spp. Trên thực tế, chỉ có thể phát hiện tình trạng của bệnh khi cây bắt đầu xuất hiện các triệu chứng bộ lá bắt đầu suy giảm nên việc khống chế và phòng trừ sẽ rơi vào tình trạng bị động và gặp rất nhiều khó khăn, kém hiệu quả dẫn đến cây chết, dịch bệnh lây lan trên diện rộng. Vì vậy, để phòng trừ có hiệu quả cần có các biện pháp phòng trừ tích cực, hiệu quả, chủ động. Một số biện pháp phòng trừ: biện pháp chọn giống, biện pháp canh tác, biện pháp hóa học, biện pháp sinh học. Có 2 dạng phòng trừ sinh học:  Phòng trừ sinh học nhân tạo bằng cách nhân nuôi các tác nhân sinh học để đưa ra đồng ruộng.  Phòng trừ sinh học tự nhiên bằng cách duy trì nguồn thiên địch sẵn có trong tự nhiên để hạn chế mật độ tuyến trùng. Hiện tại biện pháp phòng trừ sinh học vẫn chưa thể thay thế biện pháp hóa học do tác động chậm, giá thành các chế phẩm sinh học còn cao và không đáp ứng đầy đủ nhu cầu sản xuất. Tuy nhiên, phòng trừ sinh học rất phù hợp trong hệ thống quản lý tuyến trùng. Trong đó, việc nghiên cứu, tìm tòi về khả năng đối kháng, ký sinh là những bước tiến quan trọng đang được quan tâm và phát triển. 1.3 Tổng quan về nấm Purpureocillium lilacinum 1.3.1 Hệ thống phân loại Purpureocillium là một chi nấm trong họ Ophiocordycipitaceae. Chi này chỉ có một đại diện duy nhất là Purpureocillium lilacinum (hay còn được biết đến với tên phổ biến Peacilomyces lilacinus). Nấm sợi Purpureocillium lilacinum là loài hoại sinh khá phổ biến và đang được chú trọng vì có tiềm năng trong việc kiểm soát mật độ của tuyến trùng gây hại trên cây trồng. Phân loại theo Jennifer và cs năm 2011 như sau: Giới: Fungi Ngành: Ascomycota 9
  19. Đồ án tốt nghiệp Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Ophiocordycipitaceae Chi: Purpureocillium Loài: Pupureocillium lilacinum Loài Purpureocillium lilacinum được miêu tả đầu tiên bởi nghiên cứu của Charles Thomas vào năm 1910, dưới tên Penicillium lilacinum. Một số tên gọi khác của nó Penicillium amethystinum (Wehmer,1923), Spicaria rubidopurpurea (Aoki, 1941). Năm 1974, Samon đổi tên thành Paecilomyces. Những công bố trong thập niên 20 chỉ ra rằng chi Paecilomyces không phải là đơn ngành (Inglis và Tigano, 2006). Nấm này đã từng được phân loại thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes). Người ta đã phân lập được nhiều chủng nấm này từ khắp nơi trên thế giới và nó được chấp nhận như biến thể của chi Paecilomyces. Paecilomyces có mối quan hệ gần với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis và Nomuraea atypicola (Sung và ctv, 2007). Loài nấm Paecilimyces lilacinus được nghiên cứu nhiều nhất trong việc phòng trừ tuyến trùng. Năm 2011, Jennifer và cs đã đổi tên Paecilomyces lilacinus thành Purpureocillium lilacinum và sử dụng cho tới hiện tại. Những kết quả khi phân tích quan hệ phát sinh loài của các chủng Purpureocillium lilacinum chỉ ra rằng nó có liên quan chặt chẽ với Trichoderma, Gliocladium và Hypocrea hơn các loài ký sinh thuộc chi Paecilomyces, họ Hypocreales (Inglis và Tigano, 2006). 1.3.2 Phân bố P. lilacinum đã được phân lập từ các môi trường sống bao gồm đất (canh tác và không canh tác, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông), nước thải và côn trùng, tuyến trùng. P. lilacinum cũng đã được tìm thấy trong trứng và con cái của tuyến trùng sần rễ và tuyến trùng bào nang. Ngoài ra, P. lilacinum cũng được tìm thấy trong vùng rễ của nhiều loại cây trồng (Samson, 1974; Anderson và ctv, 1995). 10
  20. Đồ án tốt nghiệp 1.3.3 Đặc điểm hình thái Hình thái đại thể Bào tử nấm P. lilacinum nảy mầm khi độ ẩm và chất dinh dưỡng đầy đủ. Khuẩn lạc trên môi trường thạch PDA tăng trưởng khá nhanh, đường kính đạt 5-7 cm trong vòng 14 ngày ở 280C ± 20C, có bề mặt dạng len hoặc xốp bông, ban đầu có màu trắng nhưng khi bắt đầu phát sinh bào tử chuyển thành màu tím, hoặc màu nâu khi đưa lên ánh sáng. Một số trường hợp, bào tử không màu nhưng đa số là màu tím (Samson, 1975). Hình1.2. Khuẩn lạc P. lilacinum trên môi trường PDA sau 15 ngày nuôi cấy ở 250C (http://www.pf.chibau. ac.jp/gallery/fungi/p/Paecilomyces_lilacinus_colony.htm). Hình thái vi thể Các sợi nấm sinh dưỡng có thành trơn láng trong suốt và rộng khoảng 2,5 - 4,0 µm (Samson, 1974). Cuống bào tử đính phát sinh từ các sợi nấm cơ chất và sợi nấm dinh dưỡng, dài khoảng 400 - 600 µm. Cuống bào tử phình ra ở phía gốc và thon gọn ở phía ngọn gọi là thể bình. Bào tử đính phát sinh từ thể bình có dạng hình tròn hay bầu dục, ban đầu có vách trơn láng, sau đó trở nên hơi gồ ghề (Samson, 1974). 11
nguon tai.lieu . vn
Thạc sĩ - Tiến sĩ - Cao học Công nghệ thông tin Kinh tế - Thương mại Tài chính - Ngân hàng Kiến trúc - Xây dựng Điện-Điện tử-Viễn thông Cơ khí - Chế tạo máy Công nghệ - Môi trường Báo cáo khoa học Quản trị kinh doanh Khoa học xã hội Khoa học tự nhiên Nông - Lâm - Ngư Y khoa - Dược